Синтезируем...

Очистка олигонуклеотидов

В зависимости от последующего применения олигонуклеотидов существуют оптимальные методы очистки, которые позволяют получить продукт достаточной чистоты с минимальными затратами.

Методы очистки синтетических олигонуклеотидов

После окончания синтеза и удаления защитных групп олигонуклеотиды содержат ряд примесей:

В зависимости от последующего применения олигонуклеотидов существуют оптимальные методы очистки, которые позволяют получить продукт достаточной чистоты с минимальными затратами. Причем нужно подчеркнуть, что чем лучше проведен синтез, тем меньше примесей, и, как следствие, проще очистка. Среди наиболее еще методов очистки олигонуклеотидов можно выделить:

  1. осаждение органическими растворителями
  2. гель-фильтрация (обессоливание)
  3. обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ, RP-HPLC), как упрощенный вариант - очистка на ОФ картриджах
  4. ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (ИО ВЭЖХ, IEX-HPLC)
  5. электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ, PAGE)

Ниже мы кратко опишем принципы методов и возможные варианты их использования. Более подробно с общими принципами этих методов можно ознакомиться в замечательной книге с иллюстрациями Л.А.Остермана [1].

Самым простым методом очистки является осаждение олигонуклеотидов спиртами (этанол, н-бутанол) или ацетоном из водных растворов. Это позволяет убрать некоторые соли, а также мочевину, продукты удаления защитных групп и другие примеси. Чаще всего используется осаждение ацетоном с перхлоратом лития или натрия. Осаждение этанолом позволяет проводить очистку от ацетатов, то есть использовать осаждение для очистки олигонуклеотидов после аммиачного деблокирования или после стадии очистки с помощью ВЭЖХ. Применение бутанола дает минимальные потери олигонуклеотида, однако неорганические соли при этом убрать нельзя.

Гель-фильтрация. Принцип метода заключается в том, что большие молекулы (олигонуклеотиды) свободно проходят сквозь гель, тогда как небольшие молекулы неорганических солей и остатков защитных группировок диффундируют внутрь пористого геля и, как следствие, дольше удерживаются. Таким образом, при нанесении раствора олигонуклеотида с солями на колонку первые фракции содержат раствор олигонуклеотида, а последующие - растворы низкомолекулярных соединений. Важно подчеркнуть, что при этом отделения полноразмерных олигонуклеотидов от укороченных не происходит. Очистку можно проводить вручную (колонки типа NAP-10, GE Healthcare), с использованием центрифугирования (колонки типа MicroSpin G-25, GE Healthcare) или ВЭЖХ (колонки типа HiTrap, GE Healthcare). В последнем случае возможна автоматизация процесса, что актуально при проведении синтеза в 96-луночных планшетах.

Обращено-фазовая ВЭЖХ основана на использовании гидрофобных сорбентов и водно-органических растворов, что позволяет разделять олигонуклеотиды в зависимости от их гидрофобности. Несмотря на то, то гетероциклические основания гидрофобны [2] и при определенных условиях возможно разделение олигонуклеотидов, отличающихся на одно звено вплоть до 60-меров [3], это возможно реализовать лишь в условиях анализа. При очистке, то есть при увеличении загрузки колонки, эффективность разделения падает, что делает невозможным использовать такой подход. Однако, 5’-DMT защитная группа весьма гидрофобна и может быть удалена после очистки водным раствором уксусной кислоты. Используя это свойство, удается эффективно отделять полноразмерные олигонуклеотиды от более коротких. Как правило, водный раствор олигонуклеотида наносят на колонку и далее вещество элюируют градиентом ацетонитрила или метанола. Обычно используют ацетатный буфер с рН 7, так как впоследствии олигонуклеотид можно отделить от избытка солей высаживанием этанолом, но для G-богатых олигонуклеотидов эффективность разделения вырастает при рН 11. Часто красители сами достаточно гидрофобны, что позволяет эффективно очищать такие олигонуклеотиды с использованием ОФ ВЭЖХ, несмотря на отсутствие DMT-группы [4]. Альтернативой в случае необходимости высокопроизводительной очистки праймеров являются ОФ картриджи [5], которые являются ОФ колонками, но с размером частиц сорбента гораздо большим, чем в случае ВЭЖХ. С одной стороны, это не позволяет эффективно разделять молекулы с близким временем удерживания, с другой для работы с ними не требуется высоких давлений. Кроме того, возможно совмещение процесса очистки и последующего удаления DMT-защиты, что резко уменьшает затраты времени при высокопроизводительном синтезе в 96-луночном формате. Для олигонуклеотидов, длиной до 40-50 оснований, чистота обычно составляет около 90-95%, что вполне достаточно для проведения рутинной ПЦР, в том числе и в реальном времени, а также для многих других приложений. Достоинством метода очистки на ОФ картриджах является его дешевизна, высокая скорость очистки, а также возможность автоматизации. К недостаткам следует отнести не очень высокую степень очистки и ограничения по типам олигонуклеотидов. Из-за отсутствия 5'-DMT-группы или повышенной гидрофобности конъюгированной молекулы на картриджах не могут быть очищены многие модифицированные олигонуклеотиды.

Ионообменная ВЭЖХ - разделение веществ в методе основано на отличии в их заряде. Разбавленный раствор олигонуклеотида с низкой ионной силой наносят на колонку и далее проводят разделение за счет увеличения концентрации солей [6,7]. Более длинные олигонуклеотиды лучше удерживаются на колонке, что позволяет отделить как укороченные олигонуклеотиды, так и продукты апуринизации и ветвления олигонуклеотидной цепи. Также на время удерживания олигонуклеотида влияют гидрофобные взаимодействия, поэтому наличие красителей и/или DMT-группы в составе олигонуклеотида также приводит к увеличению времени удерживания. Как правило, чтобы нивелировать этот эффект, в буфер добавляют 5-20% ацетонитрила. Следует отметить, что оптимально использовать соли, дающие высокую хаотропность, например, бромид или перхлорат натрия. Метод подходит для эффективного разделения олигонуклеотидов длиной до 40 оснований.

Ещё одним распространенным методом очистки олигонуклеотидов является денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), который позволяет разделить молекулы за счет различий в их массе и заряде. Короткие олигонуклеотиды, имеющие меньшую плотность заряда, движутся в геле быстрее, чем полномерные олигонуклеотиды и отделяются от целевого продукта. Метод хорошо подходит для длинных и модифицированных олигонуклеотидов, позволяет получать олигонуклеотиды очень высокой чистоты, но при этом теряется значительная часть вещества. Очистка методом гель-электрофореза не требует дорогостоящих реагентов и оборудования, позволяет параллельно очищать большое количество олигонуклеотидов, но процесс достаточно трудоемок, не может быть автоматизирован и с трудом масштабируется.

Несмотря на то, что специфичность и селективность определения ДНК или РНК мишени с помощью ПЦР в значительной степени определяется именно праймерами, в большинстве случаев требования к их качеству минимальны. Для проверки эффективности и специфичности амплификации достаточно просто осаждения праймера этанолом или ацетоном. В случае использования праймеров для работы с клиническими образцами, за редким исключением, достаточно очистки с использованием обращено-фазовых картриджей. Если такой подход дает низкий выход продукта или большое количество примесей (например, в случае G-богатых олигонуклеотидов), тогда предпочтительным является использование ОФ ВЭЖХ. Если для простых олигонуклеотидов, как правило, можно подобрать один оптимальный метод очистки, то для олигонуклеотидов имеющих сложные модификации требуется комбинация из нескольких методов. Так, в случае зондов для количественного ПЦР требуется двойная очистка с использованием двух разных методов – гель-электрофорез в ПААГ (или ионо-обменная ВЭЖХ) + ОФ ВЭЖХ. Для удаления избыточного количества солей после очистки обычно достаточно высаживания олигонуклеотида этанолом, однако в ряде случаев (например, после ПААГ) оптимально использовать гель-фильтрацию.

Список литературы

  1. Л.А.Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Пособие для студентов. М.: МЦНМО, 2002.  248c.
  2. M.Gilar. Analysis and purification of synthetic oligonucleotides by reversed-phase high-performance liquid chromatography with photodiode array and mass spectrometry detection. Anal. Biochem. 298 (2), 196-206 (2001).
  3. Z.Huang, S.Jayaseelan, J.Hebert, H.Seo, L.Niu. Single-nucleotide resolution of RNAs up to 59 nucleotides by high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 435 (1), 35-43 (2013).
  4. K.J.Fountain, M.Gilar, Y.Budman, J.C.Gebler. Purification of dye-labeled oligonucleotides by ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B 783 (1), 61-72 (2003).
  5. M.Gilar, E.S.P.Bouvier. Purification of crude DNA oligonucleotides by solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 890 (1), 167-177 (2000).
  6. J.Shanagar. Purification of a synthetic oligonucleotide by anion exchange chromatography: method optimisation and scale-up. J. Biochem. Biophys. Methods 64 (3), 216-225 (2005).
  7. B.Noll, S.Seiffert, F.Hertel, H.Debelak, P.Hadwiger, H.P.Vornlocher, I.Roehl. Purification of small interfering RNA using nondenaturing anion-exchange chromatography. Nucleic Acid Ther. 21 (6) 383-393 (2011).

Наша технология работы

Научная база, накопленный опыт и техническое оснащение, позволяют быстро оптимизировать наши технологии под индивидуальные решения в области олигосинтеза.

Заказ
Оформление
Доставка

Контакты

Если вы хотите отправить нам сообщение, воспользуйтесь формой обратной связи или просто позвоните нам.

129085, Москва, ул. Годовикова, д.9, стр. 1, подъезд 1.4, помещение 1.12

+7 495 721-29-70, +7 929 692-58-64

info@genterra.ru

www.genterra.ru

Top